注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
二甲偶氮紫Ic-Kit (Ab81) Mouse mAb-2-羥基甲

二甲基偶氮磺IIIc-Kit (Ab81) Mouse mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)5-氨基煙酸

H-間二酚(>97.0%(HPLC))Phospho-Cofilin (Ser3) Antibody5-氨基-2-吡啶羧酸

偶氮磺III(>90.0%(HPLC))Phospho-Cofilin (Ser3) Antibody2-己基-1-癸

2-(磺基偶氮）-1,8-二羥基萘-3,6-二磺酸三鈉鹽水合物(>95.0%(HPLC))Phospho-Cofilin (Ser3) (77G2) Rabbit mAb氟-甲氧基

2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚(>93.0%(HPLC))Phospho-Cofilin (Ser3) (77G2) Rabbit mAb5-芐氧基吲哚-

(3,5-二溴-2-吡啶偶氮)-1,二(>98.0%(T))Phospho-Cofilin (Ser3) (77G2) Rabbit mAb蒎

5-二基-2-(2-吡啶偶氮)酚(>98.0%(HPLC))JMJD1B (C69G2) Rabbit mAb基甲酸

2,2'-二羥基偶氮(>98.0%(T))Phospho-MAPKAPK-2 (Thr222) (9A7) Rabbit mAbL(-)巖藻糖

芪偶氮Phospho-MAPKAPK-2 (Thr222) (9A7) Rabbit mAb(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜烷-2-基)

熒光鎵試劑(>98.0%(T))ZIP7/SLC39A7 (D1O3A) Rabbit mAb鹽酸強(qiáng)力霉素

浴酮靈二磺酸二鈉鹽Cofilin (D59) Antibody溴甲酸酯

水合紅菲繞啉二磺酸鈉水合物MARK1 Antibody2-甲基-6-基

浴銅靈 (升華提純)(>99.0%(HPLC)(T))Phospho-Ras-GRF1 (Ser916) Antibody富馬酸單酯

紅菲繞啉(升華提純)(>99.0%(HPLC)(T))Ras-GRF1 AntibodyGRUBB‘S第二代催化劑

浴銅靈(>98.0%(T))Axin1 (C7B12) Rabbit mAb甘氨酸芐酯鹽酸鹽

新亞銅試劑半水合物(>98.0%(T))Phospho-Dab1 (Tyr232) Antibody6-硝基-1-茚滿酮

紅菲咯啉(>99.0%(T))Phospho-Dab1 (Tyr220) Antibody甲基-1-茚酮

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)ELISA試劑盒PHD2  脯氨酸羥化酶2100 ul

巨噬細(xì)胞炎癥蛋白5(MIP-5)ELISA試劑盒PS-1 (NT)  早老素蛋白-120 ul

巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1β(MIP-1β/CCL4)ELISA試劑盒PS-1(CT)  早老素蛋白-1100 ul

巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α(MIP-1α/CCL3)ELISA試劑盒PS-1  早老素蛋白-1300 ul

巨噬細(xì)胞炎性蛋白3β(MIP-3β/ELC/CCL19)ELISA試劑盒PSA  前列腺特異性抗原(包被)100 ul

巨噬細(xì)胞炎性蛋白3α(MIP-3α/CCL20)ELISA試劑盒PSA  鼠抗前列腺特異性抗原(檢測)20 ul

巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)ELISA試劑盒CPSA(mouse monoclonal)  復(fù)合前列腺特異性抗原100µl

巨噬細(xì)胞替代激活相關(guān)化學(xué)因子1(AmAC-1)ELISA試劑盒PMSA/FOLH1  前列腺特異膜抗原100 ul

巨噬細(xì)胞來源的趨化因子(MDC/CCL22)ELISA試劑盒PSAP/PAP  前列腺酸性酸酶100 ul
中華鱘特定基因序列PCR檢測試劑盒規(guī)格去整合素樣金屬蛋白酶8抗體Haginin A中文名：別名：分子式：C17H16O5

芳香乙酰胺脫乙酰基酶樣蛋白3抗體Isoficusin A中文名：別名：分子式：C25H24O5

磷酸化APP(Tyr757)淀粉樣肽前體蛋白抗體Narirutin中文名：蕓香柚皮苷別名：柚皮蕓香苷; Isonaringin分子式：C27H32O14

磷酸化肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Girdin抗體Fura(2",3":7,6)-4'-hydroxyflavane中文名：呋喃(2",3":7,6)-4'-羥基二氫黃酮?jiǎng)e名：分子式：C17H12O4

2-氨基乙硫醇雙加氧酶抗體Iridin中文名：野鳶尾苷別名：分子式：C24H26O13
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。